În perioada 01.01.2017-01.12.2017, personalul implicat în cadrul proiectului a desfășurat activitațile specifice stabilite în Cererea de Finanțare, conform obiectivelor asumate și a obținut următoarele rezultate prezentate mai jos, cu referire concretă la fiecare dintre categoriile de tehnici și proceduri implementate.

1. Obținerea Avizului Comisiei de Etica nr. 18 / 07.04.2017 și Aplicația pentru Avizul DSV

2. Achiziții de echipamente și consumabile de laborator
a. Echipa implicată: Prof. univ. dr. Alexandru Șchiopu, Prof. univ. dr. Ovidiu S. Cotoi, Drd. Razvan Mareș, Drd. Istvan Szabo, Nicoleta Suciu.
Locația: Universitatea de Medicină și Farmacie Tîrgu Mureș.
Perioada: 01.01.2017 -01.12.2017.
b. Descriere activități: Procesul de achiziție a echipamentelor și consumabilelor de laborator a fost realizat de persoanele mai sus menționate și s-a efectuat în concordanță cu caietele de sarcini întocmite în prealabil. Achizițiile au fost făcute pe toată durata proiectului în funcție de necesitățile apărute odată cu efectuarea experimentelor.

3. Pregătire tehnica pentru lucrul cu animalele de laborator
a. Echipa implicată: Dr. med. vet. Bogdan Cordoș, Drd. Razvan Mareș, Drd. Istvan Szabo, Drd. Gabriela Pintican.
Locația: Stația Experimentală din cadrul UMF Targu Mureș.
Perioada: 01.03.2017 – 20.03.2017
b. Descriere activități: Dr. Bogdan Cardoș, medic veterinar cu o experiență foarte mare în manipularea animalelor și proceduri experimentale, a coordonat întreaga activitate desfașurată la Stația Experimentală a UMF Tîrgu Mureș și a fost responsabil de instruirea întregii echipe implicate în efectuarea de experimentelor pe șoareci.

În cadrul proiectului, experimentele se realizează pe șoareci negri C57BL/6 achizitionați de la lnstitutul Cantacuzino din București. Spațiile destinate creșterii animalelor de laborator au permis o separare adecvată a activităților, întreținerea, creșterea și găzduirea animalelor pe toată durata experimentelor, precum și efectuarea procedurilor experimentale.
S-a întocmit primul protocol de lucru: Protocolul P1 – Tehnica de manipulare și îngrijire a șoarecilor

4. Procedurile chirurgicale: pregătirea practică, perfecționarea tehnicilor chirurgicale, efectuarea intervențiilor chirurgicale
a. Echipa implicată: Drd. Razvan Mareș, Drd. Istvan Szabo, Drd. Gabriela Pintican.
Locație: 1. Centrul de Cercetare Experimentală Cardiovasculară din Malmo, Suedia – stagiu de pregătire; 2. Stația Experimentală UMF Targu Mureș
Perioada: 01.03.2017 – 01.12.2017
b. Descriere activități: În prealabil s-a efectuat pregătirea teoretică a echipei implicate, cu privire la procedurile chirurgicale care urmau a fi implementate în cadrul proiectului.

Într-o primă faza, instruirea practică a constat într-un stagiu de pregătire de o luna (24 martie – 23 aprilie 2017) efectuat de catre Drd. Razvan Mareș la Centrul de Cercetare Experimentală Cardiovasculară din Malmo, Suedia. Sub îndrumarea Prof. univ. dr. Alexandru Șchiopu și cu ajutorul post-doctorandului Goran Marinkovic, drd. Razvan Mareș a fost instruit corespunzător în următoarele tehnici chirurgicale:

• Inducerea infarctului miocardic acut (IMA) la șoareci prin tehnica “pop-up heart”: manipularea animalelor de laborator, pregătirea preoperatorie, anestezia, ligatura permanentă a arterei coronare stângi (conform modelului chirurgical nou propus), îngrijirea postoperatorie imediată și pe termen lung.
• Determinarea dimensiunii miocardului infarctizat prin injectarea intracoronariană de colorant Evans Blue, și a miocardului viabil prin reacția cu TIC (triphenyl tetrazolium chloride).
• Recoltarea de țesuturi (inima, splină) și sânge în vederea examinărilor histologice și flow-citometrice.
  La sfârșitul stagiului de pregătire Drd. Răzvan Mareș a deprins abilitățile practice necesare să efectueze independent, la un nivel satisfacator, tehnicile mai sus menționate.
  Ulterior, la Stația Experimentală de la UMF Tîrgu Mureș întreaga echipă implicată în efectuarea procedurilor chirurgicale a fost instruită conform pregătirii acumulate de Drd. Răzvan Mareș în Suedia, mai sus descrisă.
  În ceea ce privește implementarea tehnicilor chirurgicale mai sus amintite, am obținut următoarele rezultate până la momentul actual:
• Inducerea IMA: până în prezent au fost operați un număr de 102 șoareci C57BL/6 dintre care 60 au supraviețuit intervenției chirurgicale de inducere a IMA prin ligatura coronariană. Recuperarea post-operatorie și supraviețuirea animalului de experiență este dependentă de timpul procedural (optim aproximativ 1-3 minute). Estimăm că până la sfârșitul proiectului vom atinge o rata de supraviețuire de cel puțin 70%, la nivel cu studiile publicate la nivel internațional.
• lncanularea carotidiana și determinarea dimensiunii infarctului: s-au efectuat 90 de intervenții pe șoareci C57BL/6 la care rata de success a tehnicii a ajuns la peste 50%.

S-au întocmit două protocoale: Protocolul P2 – Tehnica chirurgicală pentru inducerea infarctului miocardic acut (IMA) la șoareci prin tehnica “pop-up heart” și Protocolul P3 – lncanularea carotidei și colorația Evans Blue

5. Tehnicile de flow-citometrie: pregătire practică, perfecționarea tehnicilor de flow­ citometrie, efectuarea flow-citometriei
a. Echipa implicată: Drd. Razvan Mare, Drd. Gabriela Pintican.
Locatie: 1. Centrul de Cercetare Experimentală Cardiovasculară din Malmo, Suedia – stagiu de pregătire; 2. Centrul Avansat de Cercetări Medicale și Farmaceutice (CCAMF) din cadrul UMF Targu Mureș; 3. Stația Experimentală a UMF Targu Mureș – recoltarea de țesuturi
Perioada: 01.03.2017 – 01.12.2017.
b. Descriere activități:
La Centrul Avansat de Cercetări Medicale și Farmaceutice (CCAMF) din cadrul UMF Targu Mureș, sub îndrumarea Prof. univ. dr. Minodora Dobreanu și cu ajutorul biologului Doina Manu, echipa implicată din cadrul proiectului și- a început activitatea de învățare și perfecționare a tehnicilor mai sus menționate în vederea implementării la UMF Targu Mureș a tehnicilor de citometrie în flux pentru analiza inflamației post-IMA la șoareci. Întreaga activitate s-a realizat în concordanță cu instruirea primită de Drd. Răzvan Mareș în Suedia.
Până la momentul actual, au fost efectuate analiza populațiilor celulare de interes provenite din sange și din suspensii celulare obținute din splină. Au fost sacrificați 15 șoareci C57BL/6 pentru efectuarea a 15 experimente din sange, respectiv 15 experimente din splină. S­au efectuat colorații specifice pentru fiecare populație celulară (limfocite, monocite, macrofage, neutrofile) conform panourilor de anticorpi create în prealabil și s-au elaborat următoarele protocoale:
– Protocolul P4 – Tehnica de recoltare a sângelui de la nivelul cordului soarece pentru citometria în flux
– Protocolul PS – Tehnica de recoltare a splinei de șoarece pentru citometria în flux
– Protocolul PG – Tehnica de recoltare a inimii de șoarece pentru citometria în flux
– Protocolul P7 – Colorarea imunofluorescentă a leucocitelor din sângele de șoarece
– Protocolul P8 – Colorarea imunofluorescentă a leucocitelor din suspensie celulară obținută din splina de șoarece

6. Tehnicile de histopatologei și imunohistochimie: pregătire practică, perfecționarea tehnicilor de histologie și imunohistochimie, efectuarea de histologie și imunohistochimie.
a. Echipa implicată: Prof. univ. dr. Ovidiu S. Cotoi, Drd. Razvan Mareș, Drd. Istvan Szabo și un tehnician de laborator.
Locația: 1. Stația Experimentală a UMF Târgu Mureș – recoltarea de țesuturi; 2. Centrul Avansat de Cercetări Medicale și Farmaceutice (CCAMF) din cadrul UMF Targu Mureș – prelucrarea histopatologică.
Perioada: 01.03.2017 – 01.12.2017
b. Descriere activități:
După pregătirea teoretică a echipei, au fost recoltate corduri de la animale de laborator care au supraviețuit după intervențiile chirurgicale. Recoltarea s-a facut la 14 zile și la 21 de zile postoperator. Cordurile au fost procesate în întregime și analizate la microscopul optic cu lumină transmisă. Imaginile microscopice au fost obținute la un microscop Zeiss Axioscope cu camera video și soft de captare și analizare de imagini.
Rezultatele obținute au demonstrat prezența infarctului miocardic acut după ligaturarea arterei coronare. La unele animale, aria de infarct cuprinde zonele subendocardice, la altele s-a observat un infarct miocardic extins, transmural.
Pentru a cuantifica și din punct de vedere cantitativ infarctele obținute, a fost propus un protocol de lucru prin care cordul este secționat în întregime și analizat pentru cuantificarea ariei de infarct, respectiv a volumului infarctului, asemănător cu tehnica limfonodulului santinela din patologia oncologică.
În acest sens s-au elaborat două protocoale:
– Protocolul P9 – Prelucrarea histologică a cordului de șoarece
– Protocolul P10 – Tehnica de cuantificare a ariei și volumului de infarct miocardic acut la nivelul cordului de șoarece.

La final de proiect, putem afirma că echipa de cercetare de la UMF Târgu Mureș poate realiza cu rezultate bune și valide analiza flow-citometrică din sânge, cord și splină a populațiilor celulare imune implicate în inflamația post-infarct miocardic la șoarece. În continuare expunem o parte din rezultatele obținute de-a lungul proiectului, acestea fiind în perfectă concordanță cu datele recente menționate în publicațiile științifice importante din domeniu. Datele provenite din analiza celulelor anterior menționate, obținute din sânge, cord și splină la șoareci infarctizați, au fost analizate și interpretate cu ajutorul unui soft dedicat – FlowJo v10.

Experimente realizate – imagini și interpretări

Optimizarea protocolului de lucru și titrarea anticorpilor:

Tehnica de imunohistochimie pentru cordul de șoarece a fost aplicată pe secțiuni incluse în parafină, folosind metoda manuală. Descrierea pe larg a metodei de lucru se găsește în Protocolul P12, atașat prezentului raport.

Au fost folosiți anticorpi primari de la Abcam pentru a evidenția epitopii celulelor endoteliale (anti-CD31 – clona RM00321D12, anti-neutrofile – clona NIMP-R14 și macrofage anti-CD68 – clona FA-11). Fiecare anticorp primar a fost diluat conform recomandărilor producătorului. Pentru titrare s-au folosit diluții succesive 1/50; 1/100; 1/200; 1/300. Țesuturile martor au fost reprezentate de țesuturi recoltate de la șoareci fără infarct miocardic, conform recomandărilor producătorilor: cord, plămân, ficat, splină și rinichi (Fig. 18-20).

Demascarea epitopilor s-a făcut prin metoda căldurii umede, cu ajutorul cuptorului cu microunde. Lichidul pentru fierbere – demascare a fost Citratul cu pH = 6.00.

Blocarea peroxidazei endogene s-a făcut cu H2O2. Secțiunile au fost delimitate cu creion hidrofob asigurând un bun contact al soluțiilor folosite cu secțiunile tisulare și evitând astfel pierderea de reactivi. Pentru blocarea situsurilor nespecifice s-a folosit o soluție Protein Block – Ready-to-use de la Leica Novocastra™.

Anticorpii primari diluați au fost adăugați secținilor și apoi s-a făcut incubarea peste noapte la +4°C la frigider. Anticorpul secundar folosit a fost inclus intr-un kit ready-to-use de la Leica NovocastraTM urmat de polymer ready-to-use de la Leica Novolink™, fiecare câte 30 de minute la temperatura camerei cu o spălare cu PBS între cele două etape.

Vizualizarea s-a făcut cu DAB sub control microscopic, iar contracolorarea nucleilor cu hematoxilină.